PCR法和¹⁴C呼气试验检测幽门螺杆菌的比较

临床检验杂志 1999年第1期第17卷 临床微生物学与寄生虫

作者：杨学文　王礼文　缪界平　陈亚军　陈云峰

单位：江苏省中医院，南京210029

关键词：聚合酶链反应；¹⁴C呼气试验；幽门螺杆菌

　　摘要　用聚合酶链反应(PCR)和¹⁴C呼气试验(¹⁴C-UBT)对66例上消化道疾病患者进行幽门螺杆菌(Hp)检测，结果PCR检出率为69.7%，¹⁴C-UBT检出率为71.2%，PCR、¹⁴C-UBT两种方法诊断Hp感染的敏感性均为100%，特异性分别为95.2%和90.5%，精确性分别为98.5%和97.0%；慢性萎缩性胃炎和慢性浅表性胃炎Hp检出率分别为77.8%和65.0%，两者无显著性差异；Hp感染无性别差异。研究结果表明，¹⁴C-UBT和采用自制的采样器获取胃粘膜组织进行PCR检测Hp均具有非创伤性、简便、高敏感性和特异性的优点，后者还可进行Hp细胞毒株和非细胞毒株的区分，克服了¹⁴C-UBT具有一定的放射性和使用有毒试剂的缺点。

Comparison of PCR with ¹⁴C-urea breath test for the detection of Helicobacter pylori

YANG Xuewen,WANG Liwen,MIAO jieping,et al(Jiangsu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nangjing 210029)

　　Abstract　In order to compare the value of polymerase chain reaction(PCR)with ¹⁴C-urea breath test(¹⁴C-UBT)for the diagnosis of Helicobacter pylori(Hp),specimens from 66 patients with upper gastrointestinal diseases were detected by both methods.The results showed the sensitivity of the PCR and ¹⁴C-UBT for the diagnosis of Hp infection were all 100%,the specificity were 95.2% and90.5%,and the accuracy were 98.5% and 97.0%,respectively.There were not statistically significant difference between PCR and ¹⁴C-UBT,and also between males and females.This study shows that ¹⁴C-UBT and PCR assay with selfmade sampling tool for collecting gastric secretion have the advantages of being noninvasive,simple,high sensitivity and specificity.The latter can be used to discriminate cytotoxic strains with no-cytotoxic strains of Hp,and that conquer the shortages of ¹⁴C-UBT being radioactive and using poisonous reagents.PCR assay is recommendable to apply for the diagnosis of Hp infection.

　　Key words　Polymerase chain reaction；¹⁴C-urea breath test；Helicobacter pylori

　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)的检测对其相关性疾病的诊断和疗效观察等具有重要的意义。我们应用自制的采样器采取胃粘膜标本进行PCR检测幽门螺杆菌取得了很好的效果，现将PCR法和¹⁴C尿素呼气试验诊断幽门螺杆菌感染的结果报告如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　PCR试剂　Taq DNA聚合酶购自上海Promega公司,PCR marker购自华美公司,用于扩增Hp脲酶B基因的引物由中科院上海细胞所合成,序列为^[1],HP1:5′-GAACATGACTACACCAT-3′,

　　hP2:5′-TGGTTTGAGGGCGAATC-3′。

　　1.2　¹⁴C-尿素呼气试验试剂盒　购自养和生物科技有限公司，包括¹⁴C-尿素胶囊、CO₂吸收剂、闪烁剂。

　　1.3　采样胶囊的制作　参见文献^[2]。

　　1.4　标本　来自我院消化科门诊的上消化道疾病患者66例,男性19例,女性47例,其中经内窥镜和病理组织学检查诊断为慢性浅表性胃炎40例,慢性萎缩性胃炎18例,其余8例未进行内窥镜检查。

　　1.5　标本采集

　　1.5.1　吞线团采样检查法　嘱患者早晨空腹，温开水吞入自制采样胶囊，根据患者体形，吞入线的长度约为从鼻尖到耳尖再到剑突，其余部分留于口外，45 min左右后轻轻抽提取出线团，用剪刀剪取线团部分，放入装有1 ml灭菌生理盐水的1.5 ml Eppendorf离心管中洗涤数次，洗涤液经12000 r/min离心后，弃上清，沉淀提取DNA做PCR检测。

　　1.5.2　呼气样品采样　嘱患者早晨空腹，口服 ¹⁴C-尿素胶囊1粒，20 min后让患者通过吹气导管向CO₂吸收剂徐徐吹气，当CO₂吸收剂的紫红色褪尽变为无色透明时停止吹气。

　　1.6　PCR反应　仪器为PE 9600扩增仪,扩增体积为25 μl(含10×PCR reaction buffer 2.5 μl,25 mmol/L MgCl₂ 1.5 μl,2 mmol/L dNTPs 2.5 μl,引物各50 pmol、DNA模板2.5 μl,Taq dNA聚合酶1 U、H₂O 15.3 μl),扩增程序为94℃预变性5 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 60 s,进行35个循环，最后72℃延伸5 min。扩增产物用15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，具有933 bp特异性条带者为阳性。

　　1.7　¹⁴C-尿素呼气试验　根据试剂盒说明进行，检测收集的呼气样品的每分钟衰变数(dpm)，≥200 dpm为阳性，显示胃内有Hp感染；150～200 dpm为可疑阳性；＜150 dpm为阴性。

　　2　结果

　　2.1　两种方法检测结果比较　66例患者PCR检测Hp阳性46例，检出率为69.7%，¹⁴C-UBT阳性47例，检出率71.2%，PCR和¹⁴C-UBT均阳性45例(68.2%)，PCR阳性而¹⁴C-UBT阴性者1例，PCR阴性而¹⁴C-UBT阳性者2例，PCR和¹⁴C-UBT均阴性18例，经χ²检验，两方法无显著性差异(χ²=0.33，P＞0.05)。根据中华医学会“关于幽门螺杆菌若干问题的意见(草案)”中的Hp感染诊断标准^［3］，呼气试验、PCR均阳性者可判定为Hp感染，因此，PCR，¹⁴C-UBT两法诊断Hp感染的敏感性均为100%，特异性分别为95.2%和90.5%，精确性分别为98.5%和97.0%。

　　2.2　不同性别、疾病幽门螺杆菌感染检测结果　19例男性患者经PCR和¹⁴C-UBT检测Hp感染率为63.2%(12/19)，47例女性患者Hp感染率为70.8%(33/47)，两者无显著差异(χ²=0.31，P＞0.05)；40例慢性浅表性胃炎(CSG)Hp检出率为65%(26/40)，18例慢性萎缩性胃炎(CAG)Hp检出率为77.8%(14/18)，两者无显著性差异(χ²=0.57，P＞0.05)。

　　3　讨论

　　我们应用自制采样器获取胃粘膜标本进行PCR检测Hp，解决了取样问题^［2］；尿素呼气试验以其无创伤、高敏感性而被患者接受。本实验中PCR所采用的引物是基于脲酶B基因，扩增片段为933 bp(817～1750)^［1］，此外，我们尚用Hp 16S rRNA基因设计的引物进行PCR扩增，对同样标本进行了检测，其结果一致。

　　本实验结果表明，慢性萎缩性胃炎和慢性浅表性胃炎Hp检出率分别为77.8%和65.0%，无明显差异，与李南云等报道的有所不同^［4］，这可能与所采用的实验方法不同有关；衣美英等报道慢性萎缩性胃炎和慢性浅表性胃炎Hp阳性率分别为77%和84%^［5］，其慢性浅表性胃炎的Hp阳性率与我们的结果相差较大，这可能和所采用的Hp感染阳性判断标准不同所致。我们的实验结果还显示，Hp感染无性别差异。

　　PCR和¹⁴C-UBT两方法均具有非创伤性、简便、高敏感性和特异性的优点，两者检测结果无明显差异，但¹⁴C-UBT具有一些不足之处，(1)¹⁴C具有一定的放射性，(2)试验中所用的甲醇和甲苯为易燃有毒物品，(3)无法区分Hp为细胞毒株或非细胞毒株。而PCR法没有这些不足，可应用PCR法检测Hp的cagA和vacA基因以判断细胞毒株和非细胞毒株(将另文论述)，且能无损伤的获取胃粘膜组织进行PCR，较¹⁴C-UBT有更大的应用价值。

　　参考文献

　　1　Clayton C.L,Kleanthous H,Morgan D D,et al.Rapid detection of helicobacter pylori by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis. J Clin Microbiol,1993,31∶1420

　　2　王礼文，杨学文，李克涓，等.非损伤性胃内采样法用于诊断幽门螺杆菌感染.中华医学检验杂志，1998，21(4)∶243

　　3　关于幽门螺杆菌若干问题的意见(草案).中华内科杂志，1997，36(7)∶438

　　4　李南云，张泰和，金行藻，等.幽门螺杆菌与胃癌及胃异型增生.江苏医药，1994，20(7)∶350

　　5　衣美英，刘昌平，李启霞，等.幽门螺杆菌的微生物学检查及药敏试验报告.济宁医学院学报，1994，17(1)∶29

(1998-03-15收稿，1998-10-18修回)