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幽门螺杆菌及其cagA因子与胃腺癌的关系 癌症 2000年第3期第19卷 基础研究 作者：陈奕贵 陈玉丽 吴婷 王承党 刘豫瑞 潘玉凤 单位：陈奕贵（福建医科大学附属第一医院消化内科,福建福州350005）； 陈玉丽（福建医科大学附属第一医院消化内科,福建福州350005）；吴婷（福建医科大学附属第一医院消化内科,福建福州350005）；王承党（福建医科大学附属第一医院消化内科,福建福州350005）；刘豫瑞（福建医科大学附属第一医院消化内科,福建福州350005）；潘玉凤（福建医科大学附属第一医院胃镜室，福建福州350005） 关键词：幽门螺杆菌（Hp）/基因型；细胞毒素相关基因（cagA）；胃癌/病因学 摘 要：目的：探讨Hp与胃腺癌的相关性,特别是cagA因子与胃腺癌的相关性。方法：利用血抗Hp－IgG、RUT、PCR-Hp－DNA3种方法检测270例病人耳垂血或胃粘膜活检组织中的Hp及其cagA基因。结果：Hp感染率为68.52％（无性别差异），cagA＋Hp感染率为54.73％（男性64.00％＞女性41.94％,P＜0.05）。cagA＋Hp致胃炎程度及活动性均较cagA－Hp及Hp-者高（P＜0.05）；男性感染cagA＋Hp更易发展为CAG、IM（P＜0.05）；感染Hp者胃腺癌的分化程度低，且向周围浸润及淋巴结转移的能力强（P＜0.05）,但与cagA因子无关（P＞0.05）；非贲门腺癌患者血抗Hp－IgG抗体阳性率为76.32％，大于贲门癌（52.90％）（P＜0.05）。结论：Hp感染与胃腺癌发生、发展相关；cagA因子可能为胃腺癌，特别是男性胃腺癌的致癌因子之一，主要作用于胃腺癌发生的早期阶段。 分类号：R735.2 文献标识码：A 文章编号：1000－467X(2000)03－0226－04 The relationship between Helicobacter pylori, its cagA factor and the gastric adenocarcinoma CHEN Yi－gui CHEN Yu－li WU Ting et al. （Department of Gastroenterology, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005,P.R.China） Abstract：Objective： To investigate the relationship between Helicobacter pylori (Hp), especially its cagA factor, and the gastric adenocarcinoma (GAC). Methods：The Hp in gastric biopsy specimens from 270 patients with chronic gastritis or GAC, were detected by PCR，the serum anti－Hp－IgG detection and RUT while cagA gene expression was detected by PCR. Results：The infection rate of Hp was 68.52％ without difference between sex, while of cagA＋ Hp strains infection it was 54.73％ (64.00％ in male patients, 41.94％ in female patients, P＜0.05). The inflammatory index and activity in gastric mucosa induced by cagA＋ Hp strains were higher than that induced by cagA－ Hp strains or that without Hp infection (P＜ 0.05). The prevalence of chronic atrophic gastritis (CAG) or intestinal metaplasia(IM) was higher in the male patients infected with cagA＋ Hp strains than that infected with cagA－ Hp or uninfected with Hp (P＜ 0.05). The GAC infected with Hp had lower differentiation, more noncardiac adenocarcinomas, and higher invasive or lymph node metastatic abilities than that without Hp infection (P＜ 0.05), but not correlated with the cagA factor (P＞0.05). Conclusions： The infection of Hp is correlated with the genesis of GAC, that influence the development of GAC via non－cagA pathways. The cagA factor may be a carcinogenic factor of GAC, especially in the male GAC, and may play a role in the early stage of gastric carcinogenesis. Key words：Helicobacter pylori(Hp)/Genotype; CagA gene; Stomach neoplasms/Etiology▲ 近年来大量研究表明幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染与人胃癌发生相关，特别是与非贲门肠型腺癌发生相关，并认为其可能作用于胃癌发生的起始阶段，是胃癌发生的“启动子”之一[1～3]。1994年WHO/IARC会议确定Hp作为一类致癌原，为胃腺癌较明确的致癌原之一[4]。 细胞毒素相关蛋白(Cytotoxin associated protein,CagA，其基因为cytotoxin-associated geneA,cagA)为Hp重要的毒力因子。许多研究发现：CagA与胃粘膜萎缩及肠化密切相关[5]；感染CagA＋Hp株的患者发展为胃腺癌的危险性比感染CagA－Hp及Hp－的患者高[6]。故多数学者认为CagA可作为Hp重要的毒力因子，并认为此因子与胃腺癌发生相关，可能是致癌因子之一。 胃癌(Gastric Carcinoma，GC)是严重危害人类健康最常见的恶性肿瘤之一，而福州地区又是胃癌高发区之一。已有足够的流行病学和病理学证据表明，慢性浅表性胃炎(Chronic superficial gastritis，CSG)→慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis，CAG)→伴肠化(Intestinal metaplasia，IM)→伴不典型增生(Dysplasia，Dys)→胃腺癌（Gastric Adenocarcinoma,GAC),为胃腺癌、特别是肠型胃腺癌发生的演变过程。 本课题通过检测福州地区胃腺癌演化系列患者胃粘膜中的Hp及其cagA基因,来探讨Hp及其cagA因子与胃腺癌的相关性。 1 对象与方法 1.1 研究对象与标本收集 1.1.1 对象：随机选择1998年2月～6月来我院接受胃镜检查及行胃腺癌切除术的福州地区患者（近4周未服抗Hp药物者）共270例，其中男160例，女110例，年龄17～76岁，平均46±18岁。 1.1.2 标本收集：每例受检者采耳垂血一滴，滴于抗Hp-IgG快速测试条上；胃镜检查时在胃窦距幽门3cm以内活检二块胃粘膜组织，一块即刻行RUT检测，另一块送于－70℃冰箱保存，备用于PCR-Hp-DNA检测。 1.2 方法 1.2.1 抗Hp-IgG检测：选用美国赠送以斑点金免疫渗滤试验(Dot Immunogold Filtration Assay,DIGFA)原理制成的抗Hp－IgG快速测试条，采耳垂血一滴，即刻滴于抗Hp－IgG快速测试条上，阳性反应为试条上出现红色指示带，阴性则无显色反应。 1.2.2 RUT：采用三明三强公司HpUT－H104试剂盒(分析化学法)，活检组织置于试剂板中观察，5分钟以内显黄至棕黄色则为阳性，不变色为阴性。 1.2.3 PCR-Hp-16SrRNA基因：采用上海永朋(分子生物制剂)公司的HP基因检测试剂盒，引物序列为：CP-1：5’-GCG CAA TCA GCG TCA GGT AATG-3’，CP-2：5’-GCT AAG AGA TCA GCC TAT GTC C-3’，扩增片段500bp[7]。取冷藏胃粘膜标本，加入100μl裂解液，混匀，加入10mg/ml蛋白酶K4μl，55℃水浴1小时，取出后再沸水浴5分钟，离心(15000r/min)5分钟，取上清液10μl做模板。采用25μl扩增体系，扩增反应在Perkin－Elmer公司的PE9600仪上进行：93℃4分钟，而后93℃30秒→50℃30秒→72℃60秒,循环35次，最后72℃5分钟，扩增产物以2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪下检测，出现与阳性对照同一位置的明显条带则为阳性。每次扩增时设阳性对照、阴性对照及空白对照。 1.2.4 PCR-Hp-cagA[8]：设计引物序列为：F1：5'-GAT AAC AGG CAA GCT TTT GAG G-3',B1：5'-CTG CAA AAG ATT GTT TGG CAG A-3'（由上海植物生理研究所合成）,扩增产物349bp，扩增条件为：95℃5分钟，而后95℃1分钟→55℃1分钟→72℃1分钟，循环35次，最后72℃5分钟。其余同PCR-Hp-16SrRNA基因。 1.2.5 诊断Hp感染（Hp现症感染或Hp＋）标准：抗Hp-IgG、RUT、PCR-Hp-16SrRNA基因三项检测中二项及以上阳性，则诊断Hp＋，三项均阴性诊断Hp－，单项阳性者剔出本试验。 1.2.5 病理分组：根据病理结果，选出胃腺癌演化系列病例参与本试验，其余剔出本试验。 1.2.6 标本分类、分组：根据Hp及cagA检测结果，将标本分为cagA＋Hp、cagA－Hp、Hp-3大类；结合病理分组将标本共分为3类5组。选出标本共216例。 1.2.7 炎症程度(Inflammation Indexes,II)及炎症活动度（Inflammation Activity,IA）评分：对入选的慢性胃炎，按照1990年悉尼系统分类法，对胃炎的炎症程度及活动度评分：1).炎症程度积分(II)计算方法：无炎症为0分,轻度为1分,中度为2分,重度为3分；2).炎症活动度(IA)指活动性胃炎占同组胃炎的百分比。 统计学处理：所有数据统计用统计学软件包SPSS8.0版统计。率的比较用χ2检验或Fisher's精确检验；均数以 ±s表示；不配对非参数检验，两组间比较用Mann Whitney U检验，大于两组间比较用Fisher’s Protected Least检验；相关分析用Spearman’s相关分析。取P＜0.05为差异有显著性． 2 结果 2.1 福州地区胃癌演化系列患者Hp、cagA＋Hp感染情况及其性别差异 福州地区总Hp感染率为68.25％，无性别差异（男66.13％,女71.26％,P＜0.05）．单指标血抗Hp-IgG阳性率为81.48%（220／270）；胃腺癌演化系列中，Hp感染率在CAG阶段以前是女性高于男性（P＜0.05），到CAG阶段两者相似，CAG阶段以后是男性高于女性；神州地区总cagA+Hp感染率为54.17%，男性高于女性（男63.41%，女41.94%，P＜0.05）．cagA+Hp感染率从CSG（中度）阶段起一直为男性高于女性（P＜0.05），感染高峰男性是在CAG、IM阶段，女性在CSG（中度）阶段略高，其他阶段稳定在低水平．Dys组因例数太少统计学意义不明显（见表1）． 表1 福州地区胃腺癌演化系列患者 Hp及cagA＋Hp感染情况 | 病理分组 | n | Hp＋率(％) | cagA＋Hp＋率(％) | | 男 | 女 | 总 | 男 | 女 | 总 | 男 | 女 | 总 | | CSG(轻度) | 31 | 31 | 62 | 58.54 | 77.42b2 | 66.13 | 29.41 | 37.50 | 34.15 | | CSG(中度) | 17 | 15 | 32 | 70.59a2 | 86.67b2 | 78.13 | 64.29a1 | 53.85 | 64.00 | | CAG | 16 | 13 | 29 | 75.00al | 76.92 | 75.86 | 83.33a1 | 40.00b1 | 63.64 | | IM | 25 | 18 | 43 | 76.00al | 55.55b2 | 67.44 | 73.68 | 40.00b1 | 63.64 | | Dys | 4 | 1 | 5 | 100.00 | 0 | 80.00 | 75.00 | 0.00 | 75.00 | | GAC | 35 | 10 | 45 | 62.86 | 50.00 | 60.00 | 63.64al | 40.00b1 | 59.26 | | 合计 | 128 | 88 | 216 | 67.19 | 70.45b2 | 68.52 | 64.00 | 41.94b1 | 54.73 | 2.2 Hp感染及其cagA因子与患者CAG，IM发生年龄的关系 CAG组、IM组及GAC组中Hp+患者平均年龄均较Hp-患者小（P＜0.05），与cagA无关（P＞0.05）．神州地区Hp感染年龄较早，21～60岁均在高水平，男性在31～50岁阶段cagA+Hp感染率均高于70％（数据未列表中）． 2.3 Hp感染及其cagA因子与慢性胃炎患者胃粘膜炎症程度及炎症活动度的关系 感染cagA+Hp慢性胃炎患者胃粘膜炎症程度及炎症活动度均较感染cagA-Hp或未感染Hp者高（P＜0.05），相关分析表明cagA因子为胃粘膜炎症程度及炎症活动度相关因子（P＜0.05）．（见表2） 表2 Hp感染及其cagA因子与慢性胃炎炎症程度(II)及炎症活动度(IA)关系 | Hp分类 | CSG | CAG | IM | | Ⅱ | IA(％) | Ⅱ | IA(％) | Ⅱ | IA(％) | | cagA＋Hp | 1.87±0.25a2 | 23.33a2 | 1.88±0.24a2 | 42.86a1 | 1.60±0.15a3 | 27.28a2 | | cagA－Hp | 1.42±0.19 | 16.66 | 1.32±0.23 | 12.50 | 1.25±0.19 | 18.18 | | Hp＋ | 1.62±0.20b2 | 24.24b1 | 1.67±0.23b2 | 31.82b1 | 1.46±0.18b3 | 24.13b1 | | Hp－ | 1.12±0.11 | 7.40 | 1.15±0.14 | 0.00 | 1.10±0.12 | 7.14 | a1P＜0.01，a2P＜ 0.05，a3P=0.08，vs同组cagA－Hp类 b1P＜0.01，b2P＜0.05,b3P=0.06,vs同组Hp－类2.4 Hp感染及其cagA因子与CAG、IM发生的关系 男性感染vagA+Hp者发展为CAG、IM的机率较感染cagA-Hp者或未感染Hp者高（P＜0.05），cagA因子与男性CAG、IM的发生相关（P＜0.05）；女性感染cagA+Hp者发展为CAG的机率与感染cagA-Hp者或感染Hp相似（P＞0.05），发展为IM的机率Hp-者反而比前二者高（P＜0.05），cagA因子与女性CAG、IMr v tg fq ud (P＞0.05).(见表3） 表3 Hp感染及其cagA因子与CAG、IM发生的关系 | Hp分类 | 性别 | n | CAG | IM | | n | % | n | % | | cagA＋Hp | 男 | 38 | 10 | 26.32a1 | 14 | 36.84a2 | | 女 | 24 | 4 | 16.67a3 | 4 | 16.67a3 | | cagA－Hp | 男 | 22 | 2 | 9.09 | 5 | 22.73 | | 女 | 33 | 6 | 18.18 | 6 | 18.18 | | Hp＋ | 男 | 60 | 12 | 20.00b2 | 19 | 31.66b2 | | 女 | 57 | 10 | 17.54a3 | 10 | 12.54b1 | | Hp－ | 男 | 29 | 4 | 13.79 | 6 | 20.69 | | 女 | 20 | 3 | 15.00 | 8 | 40.00 | a1P＜0.01，a2P＜ 0.05，a3P＞0.05，vs同组同性别cagA－Hp类b1P＜0.01，b2P＜0.05,b3P＞0.05,vs同组同性别Hp－类2.5 不同部位胃腺癌的Hp及cagA＋Hp感染率 Hp及cagA＋Hp感染率在贲门癌与非贲门癌相似（P＞0.05），但单从血抗Hp－IgG阳性率来看：非贲门癌血抗Hp－IgG阳性率为76.32％（29/38），大于贲门癌52.90％（P，0.05）．（数据未列表中） 2.6 Hp感染及其cagA因子与胃腺癌部位、分化、浸润深度及淋巴结转移的关系 感染Hp的胃腺癌患者分化程度较未感染者低，且向周围浸润及淋巴结转移的能力强（P＜0.05），但与cagA因子关系不显著（P＞0.05）；Hp感染者贲门癌发生率偏高（P=0.06），但与cagA因子无关（P＞0.05）（见表4）。 表4Hp感染及其cagA因子与胃腺癌部位、分化、 浸润深度及淋巴结转移的关系(单位：％) | Hp分类 | 胃底、贲门 癌发生率 | 低分化癌 占百分率 | 浸润至浆膜 外发生率 | 淋巴结 转移率 | | cagA＋Hp | 33.33a | 75.00a | 87.71a | 71.43a | | cagA－Hp | 36.36 | 84.62 | 78.75 | 80.00 | | Hp＋ | 34.62b3 | 80.21b1 | 73.91b1 | 77.27b2 | | Hp－ | 27.77 | 22.22 | 46.15 | 53.85 | aP＞0.05,vs同组cagA－Hp类； b1P＜0.01,b2P＜ 0.05,b3P=0.06,vs同组Hp－类 3 讨论 近年来的流行病学资料及前瞻性、回顾性研究表明Hp与胃癌，特别是肠型非贲门区腺癌关系更密切，这与Hp多寄居胃窦部这一现象是一致的[1,2]。Hp在我国有较高的感染率(41.4％～83.3％)，Hp感染与GC发生的地域分布呈明显的一致性。胃癌高发区Hp感染率高且血清中抗体水平亦高于低发区，高发区儿童感染率高，感染年龄偏早[3]。 1990年发现空泡毒素往往与Hp128KDa蛋白密切相关；1993年分离出此蛋白，血清学检测大约60％Hp产生此蛋白，鉴于与空泡毒素密切相关而功能又不清楚，故称之为细胞毒素相关蛋白(CagA)；同年克隆出此蛋白基因(cagA)，并发现亦只有60％的Hp具有此基因[9]。1995年XIANGZY等研究发现：Hp菌株大部分(72％)可分为CagA＋/VacA＋、CagA/VacA两大类型(TypeI,TypeII)，28％为中间型[10]。许多研究发现：CagA＋Hp感染率在胃癌高发区成人、儿童中相当高[11]；CagA与胃粘膜萎缩及肠化密切相关[5]；感染CagA＋Hp株的患者发展为胃癌的危险性比感染CagA及Hp的患者高[6]，CagA＋Hp感染与食管、贲门癌发生率成反比[12]。故多数学者认为CagA可作为Hp重要的毒力因子，并认为此因子与胃癌发生相关，可能是致癌因子之一。 我们研究发现：福州地区总Hp及cagA＋Hp感染率较高，感染年龄较早，与福州地区胃腺癌发生率高相一致。 感染Hp的慢性胃炎患者胃粘膜炎症程度及炎症活动性均较未感染Hp者高，cagA因子为相关因子；Hp持续感染者胃粘膜萎缩、肠化及胃癌发生的年龄提前；男性患者感染此cagA＋Hp毒力株后发展为CAG、IM的概率明显升高。 以上结果虽不能肯定Hp与GAC之间的因果关系，但至少提示Hp感染，特别是cagA＋Hp的感染可能对胃粘膜，特别是男性胃粘膜的萎缩、肠化等癌前病变的形成起了促进作用，在胃腺癌发生的起始阶段起了类似“启动子”的作用。Hp感染，特别是cagA＋Hp感染与福州地区男性胃腺癌发生相关，cagA因子可能为Hp致癌因子之一。 目前对Hp感染是否致癌表示怀疑的理由主要有两种[13]：1)Hp感染率这么高而胃癌发生率却相对较低，特别是Hp感染与十二指肠球部溃疡（DU）明显相关，而DU患者往往被认为是胃腺癌低发人群，且DU和GC流行病学有明显差异；2)不同性别Hp感染率相似，但男性胃腺癌发生率明显高于女性。 根据我们的研究结果可对第二种疑问作一种可能的解释：福州地区不同性别患者Hp感染率虽然相似，但cagA＋Hp感染率却是男性明显大于女性；而且此毒力株影响亦不同：男性感染cagA＋Hp后更易往CAG、IM发展，而女性则不这样发展，女性CAG、IM的发生、发展可能与HP感染及其cagA因子无关。在CSG（中度）阶段，女性Hp感染率较男性更高，但在CAG阶段以后Hp及cagA＋Hp感染率均明显下降，特别是后者下降更明显。女性胃粘膜在CAG阶段以后可能不适合Hp，特别是cagA＋Hp的生存，生存下来的cagA＋Hp致癌作用也较弱，这可能为男性胃腺癌发生率高的因素之一。 本研究结果显示非贲门癌血抗Hp－IgG抗体阳性率较贲门癌高(P＜0.05)，支持Hp与非贲门癌关系更密切。我们研究还显示：贲门癌的Hp＋率较非贲门癌略高，感染Hp者贲门癌发生率略高，与其他报道不一致。可能原因是：本研究中Hp＋率仅提示胃窦部Hp现症感染，而非贲门癌形成后将导致Hp难于在胃窦部生存或向近端胃迁移[14]，故出现非贲门部Hp感染率较贲门部略低的结果。 本研究还提示感染Hp的胃腺癌患者分化程度较低，且向周围浸润及淋巴结转移的能力更强，但与cagA因子关系不显著。 总之，Hp感染与福州地区胃腺癌发生相关，cagA因子是致癌因子之一，cagA因子的分布特点及作用特点显示其与福州地区男性胃腺癌发生更相关；Hp还与胃癌恶性发展（非cagA因子作用）相关。 基金项目：本课题受福建省科委基金(No.98－Z－168)资助 通讯作者：陈玉丽:Tel：86－591－3357199－2482or2719 参考文献： ［1］Martin-de-Argila C， Bioxeda D， Redondoc， et al. 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